DEITOX - CITEDEF
Departamento de Investigaciones Toxicológicas

MECANISMOS DE DAÑO CELULAR POR TÓXICOS. EL MODELO CCl₄ - HÍGADO.

El proyecto inicial y madre de las contribuciones que hizo el CEITOX a la Toxicología moderna estuvo vinculado con el tema clave "Mecanismos de Daño Celular por Tóxicos". Este proyecto mereció un apoyo financiero sostenido e ininterrumpido de los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos (NIH) entre los años 1969 y 1996 y contó también con subsidios a nivel nacional del CONICET y de la SECyT.

El tema elegido fue “Mecanismo de la hepatotoxicidad del tetracloruro de carbono”. Esta combinación era un sistema modelo de daño celular. Un tóxico de bajo peso molecular y que tiene un metabolismo aparentemente simple y el blanco de daño, el hígado, un órgano cuya bioquímica, función y estructura era la más conocida.

Conceptualmente el proyecto podría haberse llamado “Mecanismo de daño celular por tóxicos”, pues intentaba lograr reglas generales de porqué los tóxicos son tóxicos. Hilando más fino, podía haberse llamado, también, (y en inglés) “Chemically-induced free radical cell injury”.

Curiosamente, con este proyecto la idea fue tratar de explicar paso a paso porque el CCl₄ produce en 24 horas necrosis hepática en un 80-90% y como ese conocimiento podía ser usado para lograr mejores modos diagnósticos y tratamientos preventivos o terapéuticos. El objetivo era luego ver si las reglas de la toxicidad aprendidas y los tratamientos podían extrapolarse a
1) Efectos del CCl₄ en otros órganos.
2) Otros tóxicos hepáticos.
3) Otros tóxicos actuando en otros órganos.
4) Otros tóxicos actuando en otros seres vivos.

Al estudiar otros tóxicos hepáticos siempre nos pareció interesante incluir algunos carcinógenos potentes (como las N-nitrosaminas), también se usó el estudio de los fármacos antichagásicos Nifurtimox y Benznidazol como “otros tóxicos” actuando sobre distintos órganos (ya que era crítico ser entendido acerca de la utilidad de estos estudios). Cuando estudiamos “otros tóxicos” sobre otros seres vivos recurrimos al efecto del Benznidazol y otros compuestos actuando ahora sobre un ser unicelular relevante para ser entendido: el Trypanosoma cruzi.

Se descubrieron los procesos de activación enzimática a metabolitos reactivos (radicales libres •CCl₃) y como sus reacciones de interacción covalente o sus reacciones de abstracción de hidrógeno de blancos celulares hepáticos (proteínas, lípidos, ADN, hemo, etc.) estaban involucrados en el inicio del proceso dañino.

Nos pareció importante luego tratar de entender que eventos críticos eran lo que esos procesos iniciales disparaban vía interacciones covalentes o estrés oxidativo, y que constituían los pasos siguientes que conducían a la muerte celular. Fue entonces que necesitamos seguir ese proceso a otros niveles (por ejemplo, estudiándolo detalladamente por microscopía electrónica e histológicamente).

Como se postulaba en la época, los procesos blancos del daño de la siguiente etapa podrían ocurrir sobre las bombas de calcio presentes en microsomas y mitocondrias, y ello conduciría a una acumulación nefasta del calcio celular. Decidimos verificar si era factible emplear quelantes de calcio que tuvieran cierto grado de liposolubilidad como tratamiento contra la necrosis. Varios quelantes específicos de calcio fueron efectivos. Como muchas actividades mediadas por calcio requieren la participación de la hormona calmodulina, pensamos que esta última, quizás, también tuviera alguna participación en el proceso de daño celular. Y así pareció ser. Con conocidos fármacos, con capacidad anticalmodulínica, también pudo prevenirse en buena parte la acción necrogénica del CCl₄. Igualmente eran efectivos ciertos bloqueantes de la acción del calcio.

¿Qué proceso tan dañino iniciaba esa participación calmodulina-calcio dependiente, que llevaba a la muerte celular? Todos estos eran tratamientos que eran capaces de actuar aún seis o diez horas después de administrado el CCl₄ ¡Nunca hasta esa época se había encontrado tratamiento alguno que fuera efectivo dado después del CCl₄! Era increíble, la microscopía electrónica del hígado, a 6 y 10 horas después del CCl₄ ya mostraba daños tremendos en el retículo endoplásmico y en mitocondrias. Los tratamientos que manejábamos parecían actuar cerca del denominado “punto de no retorno”. Pero esa situación es la más común en las intoxicaciones humanas. Pudimos ver que esa acumulación de calcio-calmodulina dependiente estimulaba procesos degradativos de fosfolípidos y proteínas y potencialmente, de ácidos nucleicos. Fue así que encontramos que inhibidores de proteasas y fosfolipasas también eran capaces de prevenir a 6 o 10 horas la necrosis hepática por CCl₄. Hicimos extrapolaciones con potencialidad antidótica a otros tóxicos hepáticos como dimetilnitrosamina, tioacetamida, aflatoxina, bromobenceno, alcohol alílico, etc.

Como el CCl₄ debe su toxicidad a que es capaz de generar radicales libres (•CCl3 y CCl3O2•) y promover el proceso de estrés oxidativo (donde también se generan radicales libres y especies reactivas del oxígeno), además estudiamos la capacidad de impedir la necrosis hepática por CCl₄ con varios compuestos radioprotectores (ej. cistamina, cisteamina, cisteína, WR1605, AET, N-acetil cisteína, glutation), y todos ellos funcionaron muy bien.

También verificamos la susceptibilidad a la acción tóxica del CCl₄ en otros órganos que tienen distintos contenidos de CYP2E1 y aún en especies que casi carecen de él (ej. la gallina), y por supuesto, la gallina es resistente a su efecto, a tal punto que en una época se usaba el CCl₄ como vermicida en estas aves.

Las contribuciones del CEITOX permitieron establecer paso a paso mecanismos por los cuales las células se dañan al exponerse a este tóxico. Desde la comprensión del metabolismo activante que genera radicales libres triclorometilo, las interacciones covalentes con distintos tipos de moléculas blanco en la célula, el proceso de estrés oxidativo que altera procesos clave de la homeostasis celular, hasta los procesos degradativos que llevan a la muerte y la posterior necrosis. Más importante aún, fue posible desarrollar tratamientos capaces de interrumpir el proceso en cada paso y así proteger a las células. Los resultados permitieron establecer que las células inicialmente comienzan a dañarse de modos frecuentemente característicos de cada compuesto, pero que se encaminan luego a morir por caminos comunes. En el CEITOX se desarrollaron tratamientos capaces de bloquear esa etapa común tardía, lo cual como estrategia antidótica es algo aplicable a muchos tóxicos.